13.1. L’infezione tubercolare latente

L’infezione da Mycobacterium tuberculosis evolve in malattia tubercolare conclamata in circa il 10% dei soggetti. Nel rimanente 90% la risposta immunitaria, prevalentemente di tipo cellulo-mediato, riesce a contenere l’azione patogena dei micobatteri determinando lo stato di latenza dell’infezione (LTBI, Latent Tuberculosis Infection). La probabilità di progressione da LTBI a malattia attiva decresce con l’aumentare del tempo trascorso dal momento dall’infezione, ma qualsiasi abbassamento delle difese dell’organismo, causato da fattori endogeni o esogeni, può portare al “risveglio” dei micobatteri dormienti ed alla malattia. Il decorso subclinico e asintomatico dell’infezione latente rende problematica l’identificazione dei soggetti infetti ed il problema è aggravato dalla mancanza di test diagnostici specifici.

L’identificazione ed il trattamento chemioterapico dei soggetti portatori di LTBI è uno dei punti chiave per il controllo della malattia tubercolare nei Paesi industrializzati (9). La terapia della LTBI diminuisce infatti di circa il 60% il rischio di sviluppo della malattia attiva (38). 

13.2. Diagnosi di infezione tubercolare latente

13.2.1. L’intradermoreazione secondo Mantoux

Per decenni, la diagnosi di LTBI si è basata sull’intradermoreazione secondo Mantoux le cui basi biologiche sono schematizzate nella Figura 13.1.

Figura 13.1.

Introdotta nella pratica clinica nel 1890, l’intradermoreazione è il più antico test diagnostico ancora in uso. Il test valuta la risposta immunitaria cellulo-mediata (ipersensibilità di tipo ritardato) al derivato proteico purificato (PPD, che ha sostituito la miscela di antigeni grezzi nota come tubercolina di Koch). Il PPD è un cocktail di antigeni micobatterici estratti dal bacillo tubercolare, alcuni dei quali sono comuni a diverse specie non tubercolari ed al ceppo vaccinale Mycobacterium bovis BCG. Per tale ragione il test Mantoux ha una bassa specificità nelle popolazioni ad elevata copertura vaccinale con BCG ed in quelle in cui l’esposizione ai micobatteri non tubercolari è frequente. Anche la sensibilità è bassa, in particolar modo in presenza di condizioni che causano deficit immunitari, quali AIDS, immunosoppressioni iatrogene, tubercolosi avanzata, malnutrizione, infanzia e vecchiaia; nonché nelle fasi iniziali della malattia tubercolare. Vi sono inoltre varie problematiche inerenti al test. La corretta esecuzione del test cutaneo non è infatti semplicissima, in quanto richiede l’inoculo in sede rigorosamente intradermica, e nemmeno l’interpretazione è agevole in quanto risente molto della soggettività dell'operatore. Queste caratteristiche rendono il test poco riproducibile, soprattutto se eseguito da personale non adeguatamente addestrato. La lettura va eseguita dopo 48-72 ore, cosa che comporta notevole disagio per il paziente, che talvolta non si ripresenta.

Vi sono inoltre prove che l’intradermoreazione possa agire come una micro-vaccinazione determinando l’attivazione di cellule T specifiche, con la conseguenza che l’intensità della risposta può aumentare in modo artificioso in test seriali (effetto booster). Il test può inoltre negativizzarsi con il passare del tempo (25).

13.2.2. Interferon-Gamma Releasing Assay (IGRA)

I test denominati con l’acronimo di IGRA (Interferon-Gamma Releasing Assay) si basano sul principio che i linfociti T di individui sensibilizzati con determinati antigeni producono interferone-γ (IFN-γ) qualora vengano nuovamente in contatto con questi. La produzione di IFN-γ da parte di linfociti cimentati con antigeni del bacillo tubercolare è quindi considerata indicativa di infezione tubercolare. Gli antigeni peptidici utilizzati sono ESAT-6 (early secretory antigen target 6) e CFP-10 (culture filtrate protein 10) codificati da geni localizzati all’interno della “Region of Difference 1” (RD-1) del genoma del Mycobacterium tuberculosis. Questi antigeni sono più specifici rispetto al PPD, in quanto la RD-1 è presente in tutte le specie del Mycobacterium tuberculosis complex ad eccezione del ceppo vaccinale (BCG), mentre manca nella maggior parte dei micobatteri non tubercolari (con l’eccezione di Mycobacterium kansasii, Mycobacterium marinum, Mycobacterium flavescens, Mycobacterium gastri e Mycobacterium szulgai) (34). Tali antigeni inducono una forte risposta immunitaria da parte dei linfociti T in modelli sperimentali (2). La maggior parte dei test oggi in uso, home made o commerciali, si avvale di antigeni codificati da geni facenti parte della RD-1.

Sono commercialmente disponibili in Europa due diversi test: QuantiFERON-TB Gold (Cellestis) e T-SPOT.TB (Oxford Immunotec) (Figura 13.2).

Il test QuantiFERON-TB Gold:

Figura 13.2.

Il test T-SPOT.TB (Figura 13.2) (34):

Entrambi i test sono approvati dalle linee guida britanniche stilate dal National Institute for Health and Clinical Excellence (31). Tali linee guida raccomandano una strategia a due livelli, in cui l'intradermoreazione di Mantoux funge da test di screening ed il cui risultato, se positivo o inattendibile, dovrebbe essere confermato da uno dei test IGRA. Tale proposta è stata fatta propria dalle linee guida congiunte delle società italiane di pneumologia (4). Si tratta di protocolli tuttora in discussione che necessitano di una valutazione su larga scala riguardante sia l’impatto clinico che quello economico.

13.2.3. Sensibilità degli IGRA

La principale difficoltà nel determinare la sensibilità di un test per la diagnosi di LTBI consiste nell’assenza di un gold standard con cui confrontarlo. Si è pensato così di correlare l’esposizione all’agente infettante al rischio di infezione, valutando due parametri, vicinanza al caso indice e durata del contatto. Si assume infatti elevata la probabilità di infezione nei soggetti che hanno avuto un prolungato contatto in ambiente chiuso con pazienti bacilliferi e molto bassa quella di soggetti per i quali non risulta affatto esposizione.

13.2.3.1. Sensibilità nei soggetti immunocompetenti

Nei soggetti immunocompetenti sono stati condotti numerosi studi testando i contatti di pazienti bacilliferi, con ELISPOT e Mantoux. Dai risultati emerge che il test ELISPOT (a differenza della Mantoux) correla in modo statisticamente significativo con i due parametri presi in esame (vicinanza al caso indice e durata del contatto) (34). In alcuni studi caso-controllo, in gruppi di contatti classificati come ad alto e basso rischio di infezione, la Mantoux è risultata positiva in un numero superiore di soggetti rispetto al QuantiFERON-TB Gold. Questo dato può essere interpretato sia come maggiore specificità del test IGRA rispetto alla Mantoux, ad esempio nell’escludere i soggetti vaccinati, sia come inferiore sensibilità del QuantiFERON-TB Gold o come una combinazione di entrambe le ipotesi (34). La sensibilità degli IGRA varia notevolmente nei diversi studi (dal 58% al 100%), ma è generalmente maggiore di quella della Mantoux. Non tutti i dati pubblicati sono tuttavia concordanti; in particolare, nei pazienti non trattati, la sensibilità degli IGRA sembra inferiore a quella del test cutaneo (5).

In sistemi sperimentali la tecnologia ELISPOT è risultata più sensibile dell’ELISA per il dosaggio delle citochine (18).

13.2.3.2. Sensibilità nei soggetti immunodepressi

I soggetti immunodepressi, in particolare coloro che hanno un deficit nella risposta cellulo-mediata, sono ad alto rischio di sviluppare malattia tubercolare attiva; è pertanto importante identificare fra di essi, e sottoporre a terapia quanto più presto possibile, coloro che sono affetti da LTBI. In questi pazienti la sensibilità della Mantoux è inferiore al 50%; numerosi studi suggeriscono che la sensibilità degli IGRA sia superiore a quella della Mantoux e che, tra i due test commerciali, il T-SPOT.TB abbia una sensibilità maggiore (30). La presenza nei test IGRA del controllo positivo (mitogeno), che valuta l’efficienza della risposta immunitaria del paziente, permette di individuare i soggetti anergici nei quali un risultato "negativo" del test è da considerarsi indeterminato, perché potrebbe trattarsi di una falsa negatività dovuta ad inefficienza del sistema immunitario del paziente. Il numero di soggetti con un test indeterminato, ovvero con un elevato background nel controllo negativo o con scarsa reattività al controllo positivo è più alto negli immunodepressi ed è inversamente proporzionale al livello dei linfociti CD4. Il numero dei risultati indeterminati risulta più basso nel T-SPOT.TB rispetto al QuantiFERON-TB Gold (20).

La sensibilità del T-SPOT.TB in presenza di infezione da HIV è stata studiata da Chapman et al. (11). Essi hanno dimostrato una sensibilità pari al 100% in individui HIV-negativi e del 90% nei pazienti HIV-positivi. Elliott et al. (19) e Brock et al.(6) hanno invece riscontrato una produzione di IFN-γ, in risposta a PPD e CFP-10, nettamente più bassa negli individui HIV-positivi rispetto agli HIV-negativi.

13.2.3.3. Sensibilità nei bambini

Gli studi sull’utilizzo degli IGRA nei bambini hanno portato a conclusioni discordanti. Richeldi et al. (35) hanno segnalato un caso in cui il T-SPOT.TB è risultato affidabile nella identificazione della LTBI in un bimbo di pochi mesi e Liebeschuetz ha riscontrato la maggiore sensibilità del T-SPOT.TB rispetto al test Mantoux nei bambini con tubercolosi attiva (27), inclusi quelli in condizione di malnutrizione. A conclusioni diverse sono giunti Dogra et al. (16), non notando performance diverse tra QuantiFERON-TB Gold e Mantoux, mentre Connell et al. segnalano nei bambini una sensibilità del QuantiFERON-TB Gold inferiore a quella del test Mantoux nella diagnosi dell’infezione tubercolare latente (13).

L’utilizzo del test nei bambini al di sotto dei cinque anni è pertanto ancora argomento di discussione.

13.2.4. Specificità degli IGRA

In tutti gli studi finora effettuati, la specificità è stata calcolata su individui sani provenienti da Paesi a bassa prevalenza di tubercolosi e senza contatti noti con casi bacilliferi (30). I risultati hanno dimostrato una specificità degli IGRA elevata (89-100%) e non falsata dalla precedente vaccinazione con BCG. Al contrario, nei vaccinati, la specificità dell’intradermoreazione alla tubercolina risulta pari all'87% in uno studio di Johnson et al. (25).

13.2.5. Discordanze fra IGRA e test cutaneo

La maggior parte degli studi riporta una concordanza modesta (tra il 60 e l’80%) fra IGRA e Mantoux (30), con quest’ultima meno specifica nei soggetti vaccinati con BCG e meno sensibile nei soggetti in età avanzata e nei pazienti affetti da epatite C, alcolismo, insufficienza renale, tumore od in terapia immunosoppressiva.

Gli IGRA non risultano falsamente positivi nelle infezioni da micobatteri non tubercolari e per il momento non sono state riportate reazioni crociate neanche nei pazienti infettati da Mycobacterium kansasii, Mycobacterium marinum, Mycobacterium flavescens, Mycobacterium gastri e Mycobacterium szulgai.

Inoltre, circa un quinto dei pazienti non vaccinati con BCG, affetti da micobatteriosi non tubercolari, sono Mantoux-positivi/IGRA-negativi (30).

Prendendo in esame gli IGRA non commerciali (home-made), la specificità di quelli che utilizzano antigeni codificati dalla regione RD-1 è risultata, come atteso, maggiore rispetto agli IGRA che impiegavano PPD ed al test cutaneo, in tutte le ricerche che riportano i risultati stratificati in base allo stato vaccinale. In particolare, in uno studio di contatti (26), è stata valutata la correlazione tra i risultati del T-SPOT.TB (utilizzando come antigeni PPD ed ESAT-6) e del test Mantoux con lo stato vaccinale. L’impiego dell’antigene ESAT-6 ha prodotto risultati non correlati alla vaccinazione, mentre l’utilizzo del PPD e del test cutaneo hanno rivelato una correlazione statisticamente significativa tra positività e vaccinazione.

Uno studio danese (8) ha dimostrato che QuantiFERON-TB Gold (che utilizza antigeni codificati dalla regione RD-1) è meno influenzato dallo stato vaccinale rispetto alla versione precedente del test che utilizzava il PPD. Lo stesso autore riporta la maggior specificità del QuantiFERON-TB Gold rispetto all’intradermoreazione tubercolinica negli individui vaccinati con il BCG (7).

 In studi che valutano la sensibilità dei test IGRA e Mantoux in relazione al tempo di esposizione dei contatti alla fonte di infezione, alcuni autori (36) hanno evidenziato per i nuovi test una correlazione nettamente più alta di quella della Mantoux; altri (24) hanno rilevato, al contrario, un rapporto diretto della  percentuale di soggetti con test cutaneo-positivo e IGRA-negativo, con la durata dell’esposizione.

La riproducibilità dei risultati dei test IGRA è stata indagata in quattro diversi studi (3, 5, 21, 39). In tre di questi (3, 21, 39) la riproducibilità è risultata elevata. I risultati contrastanti del quarto studio non sono stati considerati molto indicativi in due articoli di commento (29, 37).

13.2.6. Utilizzo dei test per la diagnosi di tubercolosi attiva e per il follow-up della terapia

La limitazione principale dell’utilizzo degli IGRA per la diagnosi della tubercolosi attiva è costituita dal fatto che essi rilevano anche la LTBI. Nei Paesi a una bassa prevalenza di tubercolosi, un risultato positivo può essere, in presenza di sospetto clinico, un indizio di malattia tubercolare attiva. Nei paesi ad alta endemia, un test positivo è invece meno significativo. D’altra parte, un test negativo potrebbe, secondo Dinnes et al., escludere la diagnosi di tubercolosi (15). A conclusioni opposte giungono altri autori (14, 30, 33) i quali, avendo riscontrato una sensibilità subottimale del test QuantiFERON-TB Gold, ritengono che un risultato negativo non possa essere usato come solo parametro per escludere la diagnosi di tubercolosi attiva.

L’utilità dell’impiego degli IGRA per la valutazione della risposta alla terapia antitubercolare è stata indagata in diversi studi ma, mentre secondo alcuni (10), nei pazienti con tubercolosi attiva, la risposta ad ESAT-6 diminuisce durante la terapia, secondo altri (1), tale risposta subisce un incremento. Lavori pubblicati recentemente ipotizzano che una diminuzione della risposta all’antigene CFP-10 sia predittiva di una risposta positiva alla terapia antitubercolare (12). Secondo altri (1) il test si negativizzerebbe in risposta alla terapia solto nei pazienti con infezione recente (23).

La possibilità che mediante test IGRA si possano riconoscere, tra gli individui con LTBI, coloro che svilupperanno la malattia attiva nel futuro è stata indagata da Doherty et al. (17). Essi hanno eseguito IGRA su 24 contatti di pazienti bacilliferi utilizzando ESAT-6 come antigene. Dopo un follow-up di due anni, sette (29%) avevano sviluppato la malattia attiva: di questi, sei (86%) erano risultati IGRA-positivi, mentre tra i 17 che non avevano sviluppato malattia, solo tre (18%) erano IGRA-positivi.

13.2.7. I test commerciali

13.2.7.1. QuantiFERON-TB Gold In-Tube

Principio:

QuantiFERON-TB Gold In-Tube (commercializzato in Italia da A.D.A.) è un test diagnostico in vitro, eseguibile su sangue intero eparinizzato, che utilizza antigeni peptidici derivati dalle proteine ESAT-6, CFP-10 e TB7.7, per stimolare la risposta immune cellulo-mediata di eventuali linfociti T precedentemente sensibilizzati.

La rilevazione, mediante il dosaggio immunoenzimatico ELISA, dell'IFN-γ eventualmente rilasciato in seguito alla stimolazione, consente di accertare se i linfociti T siano stati attivati in precedenza dal contatto con Mycobacterium tuberculosis.

Reagenti:

Il sistema QuantiFERON-TB Gold In-Tube si compone di:

Procedimento:

Il sistema QuantiFERON-TB Gold In-Tube prevede la raccolta di 1 mL di sangue intero in ciascuna delle provette sotto vuoto. La provetta con il mitogeno è di uso facoltativo, ma diviene indispensabile per la corretta interpretazione del test in pazienti immunodepressi. Tale provetta può anche essere utilizzata anche come controllo della corretta processazione ed incubazione dei campioni di sangue.

La stimolazione dei linfociti avviene direttamente nelle provette che devono essere incubate, entro 16 ore dal prelievo, a 37°C, per 16-24 ore. Al termine dell’incubazione le provette vengono centrifugate ed il dosaggio ELISA dell’IFN-γ può essere eseguito direttamente sul plasma supernatante. Se il test non può essere eseguito in tempi brevi è preferibile trasferire il plasma in un'altra provetta e conservarlo in frigorifero.

I pozzetti della piastra ELISA sono rivestiti da anticorpi anti-IFN-γ; l’aggiunta successiva di un coniugato con nuovi anticorpi anti-IFN-γ e di un substrato cromogeno porta, rispettivamente, alla formazione di un sandwich ed allo sviluppo di colore.

La provetta di controllo negativo serve per valutare il “rumore di fondo” dovuto ad anticorpi eterofili o alla presenza di IFN-γ non specifico nel campione di sangue. Sottraendo la quantità di IFN-γ della provetta del controllo negativo alla quantità di IFN-γ delle provette degli antigeni e del mitogeno si determina la quantità di IFN-γ secreto in risposta, rispettivamente, alla stimolazione antigenica specifica ed al mitogeno.

Per l’interpretazione dei risultati la ditta produttrice fornisce un software per l'analisi dei dati grezzi previa verifica della linearità della curva degli standard. È comunque possibile effettuare il calcolo manualmente.

Per i dettagli tecnici si rimanda alle istruzioni del produttore.

Interpretazione:

Un test si considera negativo se la quantità di IFN-γ prodotto in risposta all'antigene è < 0,35 UI/mL o se tale quantità non è superiore, di almeno il 25%, a quella prodotta nel controllo negativo.

Un test si considera positivo se la quantità di IFN-γ prodotto in risposta all'antigene è superiore a quella presente nel controllo negativo. Una bassa produzione di IFN-γ (<0,5 UI/mL) nella provetta contenente mitogeno indica un risultato indeterminato, sempre che il campione sia risultato non reattivo nella provetta contenente gli antigeni specifici. Un’eventualità di questo genere, oltre che all'incapacità dei linfociti del paziente di secernere IFN-γ, può essere legata ad un numero di linfociti insufficiente, alla presenza di linfociti stressati a seguito di un trattamento inadeguato del campione od a procedure scorrette di riempimento e/o miscelazione della provetta con mitogeno.

Controllo di qualità:

I criteri da soddisfare per la validazione della curva degli standard prevedono che:

Qualora tali criteri non vengano soddisfatti, il test non è valido e deve essere ripetuto. 

13.2.7.2. T-SPOT.TB

Principio:

T-SPOT.TB (commercializzato in Italia da Nanogen) utilizza una versione semplificata della tecnica ELISPOT. Il test è concepito per individuare le cellule effettrici T che producono IFN-γ in risposta ad una stimolazione da parte di antigeni specifici di Mycobacterium tuberculosis.

Reagenti:

Il sistema T-SPOT.TB si compone di:

Il test è fornito in due versioni, con piastra per microtitolazione da 96 pozzetti e con piastra frazionata in 12 strip da 8 pozzetti.

Procedimento:

Le cellule mononucleate del sangue periferico vengono separate dal campione di sangue intero, lavate (per eliminare eventuali citochine adese), contate, opportunamente diluite e seminate nei pozzetti della piastra. L’inoculo risulta pertanto standardizzato. I pozzetti sono prerivestiti con anticorpi monoclonali anti-IFN-γ.

Per ciascun campione vengono utilizzati quattro pozzetti:

Il sangue può essere raccolto in provette Vacutainer di vario genere (Vacutainer CPT citrato di sodio, tubi CPT eparina sodica o tubi standard con eparina), non sono utilizzabili provette con EDTA. Il prelievo deve essere mantenuto a temperatura ambiente e non refrigerato.

Se il prelievo è eseguito con tubi CPT la separazione delle cellule è semplificata, essendo sufficiente centrifugare la provetta. In alternativa è possibile separare i mononucleati su Ficoll.

I linfociti presenti nell’anello vengono recuperati, lavati, contati e quindi diluiti (o concentrati) fino ad ottenere la concentrazione di 2.500/μL. Cento μL di tale sospensione vengono posti in ciascuno dei quattro pozzetti della piastra.

Dopo l’aggiunta dei linfociti la piastra viene incubata a 37°C per 16-20 ore, per consentire la stimolazione delle cellule T attivate eventualmente presenti. L’IFN-γ prodotto viene catturato dagli anticorpi specifici adesi al pozzetto, mentre le cellule vengono successivamente rimosse mediante lavaggio. Una nuova incubazione con un anticorpo anti-IFN-γ diretto ad un epitopo differente dal precedente e coniugato a fosfatasi alcalina permette, dopo l’aggiunta del substrato, la visualizzazione di uno spot di precipitato insolubile nel sito di reazione. Ciascuno spot rappresenta l'impronta di una singola cellula reattiva, e la conta degli spot ottenuti dà la misura della quantità di cellule T reattive presenti. Gli spot possono essere contati al microscopio, a piccolo ingrandimento, o con il lettore automatico ELISPOT (AID).

Per i dettagli tecnici si rimanda alle istruzioni del produttore.

Interpretazione:

    Il test è considerato positivo:

     Il test è considerato negativo:

    Il test è considerato indeterminato:

Nel caso che i pozzetti del controllo positivo e degli antigeni non presentino alcuna reazione, il test deve essere ripetuto per confermare il risultato.

Un risultato positivo indica con elevata probabilità che il campione contiene delle cellule T effettrici reattive a Mycobacterium tuberculosis. Essendo gli antigeni ESAT-6 e CFP-10 assenti nei ceppi BCG e nella maggior parte dei micobatteri non tubercolari, l’unica cross-reattività teoricamente possibile è quella con un’infezione da Mycobacterium kansasii, Mycobacterium szulgai, Mycobacterium marinum, Mycobacterium flavescens e Mycobacterium gastri.

Un risultato negativo indica che il campione probabilmente non contiene cellule T effettrici reattive al Mycobacterium tuberculosis.

Un risultato indeterminato è spesso correlato a carenze nel sistema immunitario del paziente.

13.3. REFERTAZIONE DEGLI IGRA

Sia che si usi QuantiFERON-TB Gold o T-SPOT.TB le indicazioni del produttore consigliano di refertare il risultato in maniera qualitativa:

Si dibatte sulla necessità di inserire nel referto anche il risultato quantitativo del test (rispettivamente in UI di IFN-g e come numero di cellule reattive). Secondo alcuni autori (32) il dato quantitativo potrebbe fornire al clinico un ulteriore parametro, durante il follow-up, per la valutazione di un’eventuale risposta alla terapia. In test seriali, il dato quantitativo potrebbe permettere di valutare la variabilità intra-individuale della risposta immunitaria.

13.4. CONCLUSIONI

Gli IGRA sono strumenti diagnostici promettenti, permettendo, rispetto all'intradermoreazione di Mantoux, una diagnosi più sensibile e specifica della LTBI e, di conseguenza, una prescrizione più mirata della terapia.

I punti, relativi ai test IGRA,  ancora da chiarire e attualmente oggetto di studio sono:

 

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